导语：脂滴在哺乳动物胚胎和卵母细胞的冷冻保存中起着重要作用，但是低温对胞内脂滴的影响以及细胞冷冻损伤的相关机制仍不清楚。近期，俄罗斯研究团队利用拉曼光谱技术揭示了细胞中脂质相变不均匀性，证实了拉曼技术在研究脂质不均匀性对生物细胞冷冻保存的影响方面具有可行性。

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在卵细胞冷冻保存过程中，除了与水冻结和冷冻保护剂毒性相关的损伤外，还会发生与细胞结构材料特性的低温变化相关的损伤。细胞的脂质结构，如膜和脂滴易受到低温损伤。在生理温度下，大多数生物相关脂质处于液态无序相状态。当冷却至低温时，脂质转变为固体状有序相。相变改变了脂质结构的材料特性，包括刚性和扩散速率。因此，这种转变可能会影响不同细胞器中与脂质相关的生物过程。

当拉曼光谱遇上冻融细胞脂滴：原位无标记捕捉脂质相变

细胞膜由具有不同熔点的磷脂混合物组成。细胞膜的现代模型是基于具有不同脂质组成的脂质结构的假设，有序相态的高熔点脂质结构被形象的称之为“筏”。不同相态的脂质共存平衡在细胞功能调节中起重要作用。温度降低会改变不同脂质相间的平衡，从而破坏膜功能。膜特性的变化可能是由于温度变化，除此之外也可能是由于水溶质效应和形成冰晶的影响，因此膜中的脂质相变（Lipidphasetransition，LPT）会影响冷冻保存后的细胞活性。

脂滴（Lipiddroplets，LDs）是富含脂质的细胞器，在脂质代谢、细胞信号传导和调节中发挥重要作用。LDs的低温变化会影响哺乳动物卵母细胞冷冻保存后的活性。一项实验证明猪胚胎细胞中LDs在耐低温特性研究中的作用明显，即预先进行机械脱水的细胞冷冻保存后在体外继续发育的存活率从0%提高到50%以上。与磷脂膜类似，LD在细胞冷冻过程中会发生LPT。通过与细胞膜进行类比，可以假设细胞质内LDs不是在特定温度的单一熔点下发生LPT，而是向不同熔点的脂质逐渐扩散转变。细胞内LD中的LPT可能会干扰细胞功能，但与LD相关的低温损伤的特定机制仍不清楚，至少到目前为止，尚无明确关于细胞膜和LD在冷冻细胞中脂质空间分离的直接证据。

红外光谱技术是研究生物细胞中脂质相态的最常用的实验方法，拉曼光谱则是另一种探测脂质相态的方法。与红外光谱相比，拉曼散射光谱可在微观尺度上研究冷冻样品，并以非接触、无标记方式进行测量。此外，拉曼技术可抗水分子物质峰的干扰。此前对卵母细胞以及胚胎中单个LD的拉曼研究表明，与甘油三酯和磷脂系统模型相比，拉曼光谱有相对较高的精度检测LPT的开始与扩散。通过相干反斯托克斯拉曼散射研究揭示白色脂肪细胞中大LD在富含脂肪酸的培养基中培养时会发生脂质相态间的分离，这种现象间接表明不同脂质在不同的温度下会发生LPT。

Cryobiology：拉曼光谱技术用于

研究细胞冻融后活性是可行的

2020年8月，俄罗斯科学院自动化和电学研究所团队在Cryobiology发表题为“Ramanspectroscopyevidenceoflipidseparationindomesticcatoocytesduringfreezing”的研究成果（图1）[1]。研究结果表明在−25°C环境下，脂质在脂滴内会以两种分离的相态共存，且在检测空间区域几微米中具有特定的空间分布，其中的高熔点脂质会分布在脂滴表面附近，而低熔/易熔的脂质分布于内部深处。拉曼光谱技术可揭示细胞中脂质相变不均匀性，证实拉曼技术在研究脂质不均匀性对生物细胞冷冻保存的影响方面具有可行性。

图1研究成果（图源：[1]）

此研究以卵母细胞作为研究对象，使用甘油/丙二醇（Propyleneglycol，PG）作为冷冻保护剂，依据标准冷冻方案对卵母细胞进行冷冻保存。具体地，该冷冻方案步骤包含四个阶段：（i）以1℃/min的冷却速率从室温冷却至-7℃；（ii）用冷铜线碰触样品以形成冰核；（iii）在-7℃下保持10分钟；（iv）以0.3℃/min的速度进一步冷却至-25℃。在大多数卵母细胞和胚胎的冷冻程序中在-7℃下保持10分钟以形成冰核，冰核形成是冰结晶所必需阶段，冷却程序在特定温度下暂停以进行拉曼检测。

拉曼采集平台采用固体激光器（激光波长为532.1nm），100×物镜（NA=0.75），横向分辨率~0.6µm，纵向分辨率~10µm，光谱分辨率为2.5cm-1；以扫描模式测量了一组拉曼光谱，并在指定坐标处探测了拉曼散射；光谱检测范围为1000至3200cm-1，曝光时间3s；在单个拉曼成像实验中测量约2500条光谱。初步数据处理包括测量光谱中高能离子宇宙线去除、基线校正等。进一步的多变量分析包括用于奇异值分解，以及使用交替最小二乘算法对拉曼光谱进行非负矩阵分解等数据处理方法。

研究结果发现：

1、不同温度下脂滴的拉曼光谱特征具有一定规律性

如图2所示，在不同的冷冻温度下收集卵母细胞的拉曼光谱，并分析对脂质相变敏感的aCH2键在拉曼频移2882cm-1处的特征表达，其峰值用来表达不同温度下的脂质相态；通过在~2850cm-1处具有强烈拉伸对称CH2(sCH2)峰，可以在拉曼图中识别出富含脂质的物质。经过统计，在不同温度下脂滴的光谱特征具有一定规律，不同温度时光谱峰值均数：n=1666@-25℃；n＝1214@-15℃；n＝636@-3℃；n=478@+5℃；n=638@+15℃；在-3℃及以下测量的拉曼光谱（图2b）表明拉伸反对称CH2(aCH2)峰对LPT敏感。以上统计的数据表明，LPT开始发生的温度是在+5和-3℃之间。

图2卵母细胞在不同温度下拉曼光谱的平均光谱（图源：[1]）

图6从指纹光谱区域获得的在-25℃条件下冷冻在PG溶液中的卵母细胞中脂滴的拉曼谱图（图源：[1]）

注：（a）有序状态的脂质拉曼图（IOL）；(b)IC=C/IC=O比率的空间分布；(c)多变量分析得出的指纹区域中的光谱成分；(d)IC=C/IC=O比率分布的直方图。

此项研究使用显微拉曼光谱成像技术来揭示了冷冻过程中卵母细胞内LD的脂质相分离现象。并使用甘油和丙二醇作为冷冻保护剂进行卵母细胞冷冻实验，实验结果证实脂质在LD内按照不同脂质不饱和度进行分布，研究数据还表明，饱和脂质可能在LD表面发生LPT，而不饱和脂质是在LD核心处保持着无序的液相状态。

在许多哺乳动物中，LD会影响细胞活性，细胞内脂质的增加量是胚胎冷冻保存成功的主要限制。尽管几十年来已经研究了高脂质含量的卵母细胞和植入前胚胎的冷冻保存问题，但富含脂质的卵母细胞和胚胎的冷冻损伤研究仍然很少。在温度升高到LPT开始以后的脂质重新分布对细胞的作用仍不清楚。在有序相熔化后，LD内的大多数脂质很有可能都混合到均匀的混合物中。然而，冷冻后混合脂质所需的时间是未知的，需要更多的研究来揭示脂质再分布的不同方面及其对冷冻保存后细胞存活和发育的影响。脂质再分配的作用可以在细胞解冻后立即在细胞存活和脂质代谢中发挥重要作用。拉曼光谱似乎是研究生物细胞中LPT的一种前瞻性方法，可提供有关微米级脂质分布的信息。此项研究证明拉曼为研究与LD相关的低温损伤机制以及制定减轻这些损伤的策略开辟了新的可能性。

排版|乔维钧

参考资料：

[1]MokrousovaVI,OkotrubKA,AmstislavskySY,;95:177-182.doi:10.1016/:32171795.

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